Grabungen Ende der 1970-er Jahre belegen, dass der erste Kirchenbau aus der Zeit vor 1220 stammt. Im 14. Jahrhundert wurde dieser durch einen größeren Bau ersetzt, wobei lediglich der Vorgängerturm übernommen wurde. Er besaß einen dreijochigen Chor, der dem heiligen Bartholomäus geweiht war und bildete den direkten Vorgängerbau des heutigen St.-Georg-Münsters.
Im Inneren der Kirche befinden sich sechs Altäre: der Hochaltar, der Josephaltar, der Kreuzaltar, der Dreifaltigkeitsaltar, der Sebastiansaltar und der Zibrionenaltar.
Zusätzlich beherbergt die Kirche die Kanzel mit ihrem sechseckigen Kelch, den Taufstein, die dreimanualige Rieger-Orgel von 1997 und das Sakramentshaus.
Die Heiliggeistkirche im Spital ist seit 1567 Gotteshaus des evang.-luth. Bevölkerungsteils. Im gotischen Chorraum befinden sich reiche Fresken und ein Flügelaltar aus dem 15. Jahrundert. Der seltene Abendmahlsaltar an den Stufen zum Chorraum ist Zeuge der Reformation in Dinkelsbühl. Ungewöhnlich für eine evangelische Kirche ist das barocke Deckenfesko von Sebastian Nieberlein.